文献详解单细胞转录组GWAS联合分析揭

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今天为大家带来的依然是一篇单细胞测序在疾病研究中应用的文章。文章的整体框架可以分为两部分，第一部分是单细胞研究的“一般套路”，即通过单细胞测序对升主动脉瘤组织进行细胞分群鉴定以及细胞亚型功能注释；第二部分内容是该文章的“画龙点睛之笔”，作者将单细胞测序数据与GWAS数据结合，提取所有与动脉瘤相关的单核苷酸多态性(SNPs)，进而挖掘可能的动脉瘤相关SNPs靶基因。下面我们具体了解一下这篇文章，学习这种在套路下别具匠心的研究思路吧！

研究背景

升主动脉瘤(ATAA)是由主动脉壁进行性变弱和扩张引起的，可导致主动脉夹层、破裂和其他危及生命的并发症。已证实以平滑肌细胞(SMC)丢失和细胞外基质(ECM)降解为标志的主动脉退变是ATAA的主要特征，但导致散发性ATAA主动脉退变的分子和细胞过程尚不清楚。

研究方法

作者首先对8例动脉瘤患者和3名健康对照的升主动脉组织进行了单细胞RNA测序，随后进行了细胞分群鉴定以及细胞亚型功能注释，然后通过分析每种细胞类型的比例以及ATAA和健康对照之间的基因表达谱来确定ATAA相关基因的功能变化，最后作者将单细胞RNA测序数据与GWAS数据进行综合分析，鉴定了可能与ATAA至关重要的基因。

研究思路结果展示

1.升主动脉壁11种主要细胞类型的基因表达谱

作者首先使用Seurat将11个样本的数据组合在一起进行综合无监督细胞聚类分析，并将细胞投影到二维t-SNE图上，分析确定了升主动脉壁中的11种主要细胞类型，包括2类平滑肌细胞、成纤维细胞、间充质干细胞(MSCs)、内皮细胞、单核/巨噬细胞/树突状细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、B淋巴细胞和浆细胞。这11种细胞类型又可分为非免疫细胞和免疫细胞两大类，根据细胞类型的来源组成，发现与健康对照相比，ATAA组织中非免疫细胞较少，而免疫细胞（尤其是T淋巴细胞）较多。

2.升主动脉壁中的非免疫细胞群

已知非免疫细胞在主动脉壁中起着基础和关键的作用，为深入了解升主动脉壁中的非免疫细胞，作者对非免疫细胞类群（即2个平滑肌细胞簇、内皮细胞簇、成纤维细胞簇和间充质干细胞簇）进行了再聚类分析，获得了15个非免疫细胞亚型，并根据它们特定的基因表达谱重新命名。以下用表格的形式展示非免疫细胞群所有细胞亚型的基因表达特征：

非免疫细胞类群

平滑肌细胞（SMC）细胞亚型

基因表达

功能/特点

平滑肌细胞（SMC）

contractileSMC

高表达收缩相关基因，低表达胶原和蛋白多糖基因

参与收缩

stressedSMC

表达收缩相关基因及应激反应基因

应激反应被激活

proliferatingSMC1

既表达收缩相关基因，又表达低水平的胶原和蛋白多糖基因

具有更高的增殖程度

proliferatingSMC2

既表达收缩相关基因，又表达低水平的胶原和蛋白多糖基因

具有更高的增殖程度

fibromyocyteSMC

表达收缩基因以及细胞外基质基因

--

成纤维细胞

Fibroblast1

高表达胶原和蛋白多糖基因，高表达弹性蛋白(ELN)

--

Fibroblast2

高表达胶原和蛋白多糖基因，高表达纤维蛋白-1(FBN1)和蛋白多糖

周细胞

MSC1

表达细胞周期素，表达收缩相关基因

参与收缩

MSC2

表达细胞周期素，表达细胞外基质基因

参与细胞外基质的分泌

炎性非免疫细胞

Inflammatory1

显示T淋巴细胞样基因表达谱

--

Inflammatory2

表达几个巨噬细胞特异性基因

--

Inflammatory3

表达干扰素诱导的基因

--

内皮细胞

EC1

表达内皮标记基因

与EC2比有更大的细胞运动性或细胞迁移

EC2

表达内皮标记基因

与其他内皮细胞具有较高的细胞-细胞相互作用

施旺细胞

Schwanncells

表达NGFR22基因

具有很高的细胞-细胞连接分数

3.升主动脉壁动态单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞簇

此外，分析获得了10种髓系细胞亚型：包括M1like、M2like等：

M1like1簇表达几个细胞因子基因，表明M1like1细胞有炎症功能的。

M1like2簇还表达表皮生长因子编码基因、金属蛋白酶抑制因子编码基因TIMP1和硫酸软骨素蛋白多糖编码基因Vcan，提示M1like2巨噬细胞除了分泌炎症因子外，可能还参与组织重塑。

M1like3簇表达转录因子编码基因，也表达编码主要组织相容性复合体I类分子的基因，其特异性呈递细胞毒性CD8T淋巴细胞的抗原，说明M1like3细胞向CD8T淋巴细胞而不是CD4T淋巴细胞提呈抗原。

M2like1簇表达PDK4、STAB1、TXNIP和MAF，提示其在葡萄糖代谢、抗炎和吞噬功能中发挥作用。

M_IFNresponse簇表达多种干扰素诱导的基因，包括IFI44L、ISG15、IFIT1和IFITM3。M_remodeling簇表达几个平滑肌细胞和成纤维细胞基因，以及几个蛋白酶基因，表明M_remodeling细胞在组织重塑中起作用。

M_Proliferating簇表达组蛋白相关基因、微管相关基因以及细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基。

单核细胞簇表达NAMPT、SA9和LITAF和几个细胞因子受体基因。受体基因的高表达允许单核细胞接收信号，开始分化为巨噬细胞或树突状细胞。

树突状细胞簇表达FLT3、IRF8和CLEC9A，以及高水平的主要组织相容性复合体基因，这体现了树突状细胞作为专业抗原提呈细胞的作用。

4.升主动脉壁中的T淋巴细胞

T淋巴细胞是升主动脉组织中发现的最大细胞群，对所有T淋巴细胞进行无监督重新聚类，根据每个簇中保守基因的表达，共获得了11个T淋巴细胞亚群。

T淋巴细胞细胞亚型

基因表达特征

CD4_Active

表达具有促炎和细胞毒功能的基因

CD4_EM_REST

表达CCR7、IL7R、CCL20和KLRB1

CD4_Treg

表达基因IL2RA、CTLA4、TNFRSF18、ID3和LTB，高表达几个细胞因子基因

CD8_Active

表达细胞毒相关基因GZMK和CRTAM，炎症基因CCL4和CMC1

CD8_TEMRA

表达细胞毒基因GNLY、KLRD1和PRF1，以及CCL5和HOPX

T_HSP

包含CD4和CD8T淋巴细胞和高表达的应激反应基因

T_GIMAP

表达免疫相关蛋白家族基因GTPase

T_HSP

表达TXNIP

T_GIMAP

表达TXNIP

T_Stress

表达与应激相关的基因，如jun、fos和DNAJA1

T_proliferation

表达微管相关基因，染色质相关非组蛋白基因以及编码细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1的CKS1B

T_Switch

表达收缩相关基因TAGLN、MYH11和TPM1

5.ATAA组织中动态细胞群体和差异基因表达模式

（1）ATAA组织中线粒体功能降低

经过聚类和重新聚类，在升主动脉组织中共鉴定出40种细胞类型，接下来作者对ATAA和对照组之间按细胞类型进行了差异分析。在40个簇中，14个显示了的差异基因表达。基因集富集分析表明，在ATAA组织中有7个簇的氧化磷酸化(OXPHOS)增加。对编码OXPHOS复合物的所有97个基因的分析表明，在ATAA组织中，线粒体OXPHOS基因的表达减少，而染色质OXPHOS基因的表达增加。按细胞类型进一步检测每个基因的折叠变化显示，在ATAA组织中的40种细胞类型中，有24种明显降低了线粒体基因的表达，染色质OXPHOS基因的表达增加。因此，作者推断ATAA组织中的细胞可能表现出线粒体功能障碍，当线粒体基因表达受到抑制时，染色质OXPHOS基因的表达可能会增加，以补偿和维持细胞中关键的OXPHOS功能。

（2）ATAA组织中非免疫细胞和巨噬细胞趋化因子表达增加

细胞成分分析显示，与对照组织相比，ATAA组织中大多数非免疫细胞比例降低，免疫细胞（尤其是T淋巴细胞）比例增加。细胞周期分析显示，ATAA组织的G1期细胞比对照组织多，表明ATAA组织的增殖率较低。这也提示ATAA组织中T淋巴细胞比例的增加可能不是由细胞增殖引起的。作者根据细胞类型计算了所有趋化因子基因的折叠变化(即ATAA/对照)，并确定了23个趋化因子基因在ATAA组织中表达显著增加的簇，其中12个为非免疫细胞簇，4个为巨噬细胞簇。这表明，ATAA细胞群的改变可能主要归因于非免疫细胞和巨噬细胞中趋化因子表达的增加。

6.ATAA组织中DEGS与GWAS结果的相关性

最后，作者将单细胞RNA测序鉴定到的ATAA组织中差异表达的基因与GWAS结果(动脉瘤相关的SNPs)相结合，并使用捕获的Hi-C数据来确定它们可能的靶基因，结果发现转录因子ERG可能在维持主动脉壁功能的平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞中发挥作用。而且前人研究表明ERG抑制内皮细胞的血管炎症，ERG表达减少与动脉瘤有关。

此外，作者还根据细胞类型确定了受ERG潜在调控的基因。CFLAR、TNFAIP3和GSK3B是先前报道的凋亡抑制剂，被确定为ERG的靶点，并在EC1中下调。另一个潜在的靶基因TMEM编码胞质DNA传感接头刺突，在Fibroblast1簇中上调。这些研究结果表明，ERG可能通过直接正向调节抗凋亡基因和负向调节促炎基因，在维持正常主动脉功能方面发挥作用。

研究结论

（1）在单细胞水平上揭示了人类升主动脉壁的细胞和分子图谱，提供了多个亚型包括主动脉平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的分子图谱。

（2）在不同类型的主动脉细胞中存在线粒体功能障碍可能是胸主动脉瘤的一个特征。

（3）确定了11个可能对主动脉功能至关重要的基因。增强主动脉中转录因子ERG的活性可能是治疗胸主动脉瘤的一种策略。

（4）阐明了正常和病变主动脉不同细胞群中基因的动态表达，将有助于我们更好地理解主动脉疾病的分子发病机制，有助于开发针对这些疾病的有效药物治疗。

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