临床样品的流式细胞术检测及注意事项

流式细胞术在临床检验中具有广泛的应用。通过荧光抗体来检测抗原表达的流式细胞术，检测的样本多为外周血、骨髓、各种体液（如脑脊液、胸水、腹水）及人体的组织（淋巴结、脾脏、肝）。在进行流式细胞仪检测前，首先要进行细胞悬液的制备。

本文旨在经验分享，仅供参考，欢迎大家批评指正。

1样品制备

对样本制备，采取后尽快检测（尽可能12小时内检测），尽可能保持细胞的自然状态（处理过程尽可能少，避免固定，酶消化等处理）的原则。

1.1保存：12小时内处理的样本可以室温保存；超过24小时，采用肝素抗凝，4度冰箱保存，处理前半小时恢复室温。4度存储一般不建议超过48小时。

1.2抗凝剂的选择：常用抗凝剂有EDTA，肝素和ACD（葡萄糖枸缘酸）。细胞如能及时处理（24小时内），EDTA是最常用抗凝剂，样本在24小时内细胞稳定，尤其在细胞分类和计数时使用，但是不适合于与Ca+相关的表位的检测，如CD11b等；肝素和ACD在72小时内稳定，骨髓样本优先使用肝素抗凝，不推荐用ACD，因为ACD可能改变样本PH值，若骨髓样本在24小时内检测完可以使用EDTA抗凝剂。肝素常用于白细胞研究，尤其是不能及时研究的样本，但不适于血小板的相关抗原的检测。

1.3样本处理方法：对外周血和骨髓样本，一般直接用含有抗凝剂的试管收集样本；体液可抽取后置于肝素抗凝试管内；而各种组织，如果红细胞较多，可加入少量肝素抗凝剂，用机械法分散获得单细胞。体液样本和组织悬液-rpm离心5分钟，放于含有1%的血清的PBS中保存。骨髓样本在染色前用目尼龙网过滤去除骨髓小体后备用。细胞悬液如有细小沉淀，也需要过滤。

2样本的质量控制

2.1细胞计数：抗体孵育前，应用细胞计数仪或血球计数板对细胞数量进行准确计数，并将细胞数量调整到所需的浓度范围。

2.2细胞涂片：通过细胞涂片对细胞数量和形态学的预估，常用方法为瑞式染色法。涂片后选两块小粒较多、厚薄均匀的骨髓片，自然干燥后。加瑞氏染色液8-12滴，约半分钟后，加姬姆萨稀释液5-10滴，染色10-20分钟。再用流水缓慢冲洗干净玻片，自然干燥。肉眼检测骨髓小体和染色状态良好后，在显微镜下进行观察，对各细胞数量进行观察和计数，检测是否有异常细胞出现。3

荧光标记抗体对抗原的标记

根据临床诊断和细胞涂片的结果，选择合适的抗体对细胞进行流式细胞仪分析。

3.1细胞表面染色：

3.1.1在流式管内底部加入不同荧光标记的单克隆抗体，抗体量和细胞数量以各试剂公司提供的说明书为准。

3.1.2染色：在加有抗体的流式管底部加入适量的抗凝的细胞样本（骨髓样本先过滤去骨髓小体，防止堵塞仪器），充分混匀后室温避光约15分钟。

3.1.3裂红：加入适量红细胞裂解液，低速涡旋混匀，室温避光静置约8-10分钟。如标本量多或红细胞数量多可适当增加红细胞裂解液的体积。溶血至细胞悬液透亮后，离心洗涤。

3.1.4洗涤：弃去上清，加入适量含0.1%NaN3和1%-2%BSA的PBS洗液或流式专用CellStainingBuffer，离心洗涤。

3.1.5上机检测：弃去上清后，加入适量PBS重悬细胞，通过流式细胞仪进行上机检测。如样本不能及时上机，可在样本中加入等体积的1%多聚甲醛，混匀后4度冰箱保存，并24小时内进行检测。

3.2细胞内或者核内抗原标记

除细胞表面的蛋白外，细胞内细胞因子和细胞核内表达的大量蛋白也对细胞有重要的生理作用。在血液系统疾病的诊断中，某些需要鉴别诊断的系列特征首先出现在细胞内或者细胞核内，如髓系标志物MPO，B淋巴细胞标志物cCD20（胞内CD20）和cCD79,T淋巴细胞标志物cCD3,未成熟细胞标志物TdT,B淋巴细胞和浆细胞的标志物ckappa和clambda等。

检测细胞内抗原，需要同时标记细胞表面和细胞内抗原。首先标记细胞表面抗原，然后对细胞膜和核膜进行固定透膜，再对细胞内和细胞核内的抗原进行标记，具体流程如下：

3.2.1表面染色方法同上。

3.2.2按照不同厂商的固定破膜剂进行固定透膜。例如使用BioLegend的FixationBuffer对已表面染色的细胞在避光条件下固定20分钟后，离心洗涤；之后再用IntracellularStainingPermWashBuffer重悬细胞，重复两次以确保充分透膜。更多关于固定的注意事项，请参照之前的文章。

3.2.3细胞内抗原染色：加入相应的荧光素标记抗体于流式管内，混匀后室温避光孵育约30分钟。

3.2.4洗涤。

3.2.5上机检测：弃去上清后，加入适量PBS重悬细胞，通过流式细胞仪进行上机检测。如样本不能及时上机，可在样本中加入适量的1%多聚甲醛，混匀后4度冰箱保存后检测。

4注意事项

4.1细胞样本的制备是染色成功的关键，如骨髓样本用荧光抗体标记前先过滤，避免骨髓小体堵塞仪器；样本中脂肪和其他杂质含量多，检测血小板相关指标（CD41a，CD42b，CD61，CD62p,PAC-1,CD6,CD39等），B淋巴细胞和浆细胞的标志物ckappa和clambda进行检查时，在进行荧光抗体标记前，先用无血清的PBS洗涤3遍，再进行后续抗原标记、裂红、固定透膜等步骤。

4.2荧光抗体的选择：合适荧光抗体和浓度定量检测获得最佳信号的保证。不同对细胞上表达数量不同的抗原选用不同的荧光标记抗体，一般表达量高的抗原选择荧光亮度较弱的荧光，反之，表达量较低的抗原选用荧光亮度较强的荧光。在有其他荧光可以选用时，尽可能避免使用串联染料，尤其是在细胞内或者细胞核内抗原染色时，固定可能造成串联荧光物质解偶联。FITC染料是pH依赖的，使用时避免使用酸性缓冲液。

4.3对照设定：对照的选定对判定细胞是阴性还是阳性极其关键，一般检测都设有同型对照，表达量低或者判定不准的样本需要设FMO对照（缺一对照），同时可以用同一样本内，某抗原指标不表达的细胞作为本抗原的内对照来判定抗原表达的阴阳性和强弱。

4.4仪器校验和调整：仪器状态是检测结果正确的基础，用于临床检查的仪器应该每天进行校验。

4.5数据收集：数据收集前，用单染管或者荧光微球，遵循横平竖直原则对荧光补偿进行调整；通过FSC-H/A对单细胞群进行筛选，尤其是4色以上的多色实验取45度斜线上细胞进行分析；通过FSC/SSC对细胞碎片进行去除。

流式细胞术分析造血细胞的抗原表达情况远多余形态学结果的简单证实，能提供大量的信息。准确有效的运用流式细胞术，使其得到的结果结合临床学，形态学，细胞遗传学等方法，为疾病做出诊断和分类。

参考文献：

《实用流式细胞术——血液病篇》刘艳荣等（）北京大学医学出版社

《流式细胞术的基础和临床应用》吴长有等（）人民卫生出版社

《MethodinCellbiology》BrentWood.Vol.75()ElsevierInc.

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